1、樣品的稀釋

固體和半固體樣品：稱取 25 g 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min～10000 r/min 均質(zhì) 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 稀釋液的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min～2 min,制成 1:10 的樣品勻液.

液體樣品：以無菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中,充分混勻,制成 1:10 的樣品勻液.

2、用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注于盛有 9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面）,振搖試管或換用 1 支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成 1:100 的樣品勻液.

3、制備 10 倍系列稀釋樣品勻液.每遞增稀釋一次,換用 1 次1 mL 無菌吸管或吸頭.

4、根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),選擇 2 3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液）,在進(jìn)行 10 倍遞增稀釋時(shí),吸取 1 mL 樣品勻液于無菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿.同時(shí),分別吸取 1 mL 空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對照.

5、及時(shí)將 15 mL～20 mL 冷卻至 46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于 46 ±1 ℃℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻.

6、培養(yǎng) :待瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),36 ±1 ℃℃培養(yǎng)48 h±2 h.水產(chǎn)品 30 ±1 ℃℃培養(yǎng) 72 h±3 h.如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時(shí),可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約 4 mL）,凝固后翻轉(zhuǎn)平板,條件進(jìn)行培養(yǎng).

 

7、菌落計(jì)數(shù)

可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量.菌落計(jì)數(shù)以落

形成單位（colony-forming units,CFU）表示.

8、選取菌落數(shù)在 30 CFU～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù).低于 30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于 300 CFU的可記錄為多不可計(jì).每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù).

9、其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí),則不宜采用,而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以代表一個(gè)平板菌落數(shù).

10、當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù).