一、水煮模板法——主要用于PCR反應(yīng)

1、接種單菌落于LB或腦心平板,連續(xù)畫(huà)線,37攝氏度培養(yǎng)18－24小時(shí).

2、刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150微升三蒸水中,混勻,100攝氏度煮沸10分鐘.

3、12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,取上清,－20攝氏度保存?zhèn)溆?

    操作最簡(jiǎn)便,對(duì)試劑條件要求低.缺點(diǎn)是純度不夠高,可能會(huì)含有RNA、蛋白等雜質(zhì).但是作為一般檢測(cè)目的的PCR反應(yīng)模板已經(jīng)足夠了.

    有人稱擴(kuò)增4kb以下片段都可用此種方法制取模版,編者用此類模板PCR可以擴(kuò)增到3500bp的片段.

    編者建議:此法得到的模版保存時(shí)間短,強(qiáng)烈建議每月重新制作一次.

 

二、CTAB/NaCl 法

1、接種一單菌落于5mlLB中,30℃培養(yǎng)過(guò)夜,

2、取1ml種子培養(yǎng)液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培養(yǎng)16小時(shí);

3、5000r/min離心10分鐘,棄去上清.

4、加入10mlTE離心洗滌后,用10mlTE溶解菌體,混勻,-20℃保存?zhèn)溆?

5、取3.5ml菌懸液,加入184μl10%SDS,混勻,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混勻,37℃溫育1小時(shí)

6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混勻,65℃溫育10分鐘.

7、加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清.

8、上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清.

9、加入0.6倍的異丙醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,收集DNA沉淀,用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀.

10、用1mlTE溶解DNA,加入終濃度為20μg/mlRNaseA,4℃保存.

    CTAB/NaCl法提取的DNA純度較高,蛋白雜質(zhì)較少,保存時(shí)間長(zhǎng),編者更喜歡把終濃度為20μg/ml     RnaseA加在第5步溫育的時(shí)候,這樣最后沒(méi)有RnaseA污染.每一步操作細(xì)致一些,得到的DNA可用于Southern blot.

    編者建議:長(zhǎng)時(shí)間保存DNA可放于-20℃,但要盡量減少反復(fù)凍融,否則影響DNA質(zhì)量.

三、鹽析法

1、1.5ml對(duì)數(shù)期菌液

2、12000rpm 30 s

3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法）,37c,1hr

4、66ul 5M NaCL,混勻充分,12000rpm 10min

5、上清用粗槍頭取至新管

6、等體積酚充分混勻,12000rpm 3min,反復(fù)抽提至無(wú)蛋白層

7、取水層,等體積氯仿混勻,12000rpm 3min

8、上清至新管,2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇

9、-20C,20min,14000rpm, 15min

10、400ul 70%冷乙醇洗滌

11、干燥,100ul 20ug/ml RNaseA,37C,30min

12、2倍體積無(wú)水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗滌

13、干燥,溶于100ul TE

    介于方法一和方法二之間,CTAB雖然取出糖分效果較好,但CTAB本身也是有毒的,所以此方法放棄了CTAB.

    革蘭氏陽(yáng)性菌,由于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與陰性菌有差別,裂解比陰性菌稍微麻煩一些,可以采取CTAB/NaCl法稍加修改,在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶,37度溫育1h.

實(shí)驗(yàn)注意:提基因組最好要將槍頭尖剪掉（剪掉以后在酒精燈上迅速過(guò)一下,使其斷口圓滑）.以免槍頭損傷基因組!抽干時(shí)最好是風(fēng)干!

    較精細(xì)的實(shí)驗(yàn),如Southern,強(qiáng)烈推薦用試劑盒!