不同的化學消毒劑其作用原理也不完全相同，大致歸納為三個方面。一種化學消毒劑對細菌的影響常以其中一方面為主，兼有其他方面的作用。

　　（1）改變細胞膜通透性 表面活性劑（Surface-active agent）、酚類及醇類可導致胞漿膜結構紊亂并干擾其正常功能。使小分子代謝物質溢出胞外，影響細胞傳遞活性和能量代謝。甚至引起細胞破裂。

　　（2）蛋白變性或凝固酸、堿和醇類等有機溶劑可改變蛋白構型而攏亂多肽鏈的折疊方式，造成蛋白變性。如乙醇、大多數重金屬鹽、氧化劑、醛類、染料和酸堿等。

　　（3）改變蛋白與核酸功能基團的因子作用于細菌胞內酶的功能基（如SH基）而改變或抑制其活性。如某些氧化劑和重金屬鹽類能與細菌的-SH基結合并使之失去活性。