溶血空斑形成試驗(yàn)是一種體外檢測單個(gè)抗體形成細(xì)胞(漿細(xì)胞)的方法，故又稱體外抗體形成細(xì)胞(Plaque Forming Cell, PFC)測定技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)不僅可以作為免疫基本理論研究的有力工具，廣泛地用于檢測產(chǎn)生IgM類型(包括其它各類免疫球蛋白及其亞類)的抗體形成細(xì)胞，它還可作為臨床篩選抗腫瘤新藥以及研究中藥對抗體免疫功能影響的免疫學(xué)指標(biāo)。
一、原理：
溶血空斑形成試驗(yàn)的基本原理是將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞與一定量的綿羊紅細(xì)胞混合，在補(bǔ)體參與下，使抗體形成細(xì)胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細(xì)胞溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。根據(jù)所操作的方法不同可分為直接溶血空斑試驗(yàn)，間接溶血空斑試驗(yàn)，瓊脂固相法，小室液相法，單細(xì)胞層法等等。下面介紹直接溶血空斑形成試驗(yàn)。
二、操作步驟：
1. 底層瓊脂平皿的制備：將1.4％瓊脂加熱融化后傾注于平皿內(nèi)，每個(gè)平皿6ml，凝固后置濕盒37℃?zhèn)溆谩?br />2. 0.7％瓊脂加熱融化后加入華氏管內(nèi)，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。
3. 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液制備：用4×10３ 個(gè)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對照為等量生理鹽水。4天后，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾臟，用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3～8×10６/ml。臺盼蘭染色查活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于90％。置4℃冰箱備用。
4. 試驗(yàn)平皿的制備：依次將預(yù)溫40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4℃的脾細(xì)胞懸液各0.1ml加入預(yù)熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內(nèi)，凝固后，置37℃孵育1小時(shí)。
5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表面,再次置37℃溫育30分鐘，即可用肉眼或借助于放大鏡進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)。
三、試劑和器材
㈠ 試劑
1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配制。
2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配制
3. 25％SRBC鹽水懸液
4. RPMI1640
5. 胎牛血清，56℃30分鐘滅活，并經(jīng)SRBC吸收
6. 補(bǔ)體：新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)SRBC吸收后，用RPMI1640稀釋。
㈡ 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管，1ml注射器，不銹鋼篩網(wǎng)，青霉素瓶，離心管，不同規(guī)格加樣器等。
四、注意事項(xiàng)：
1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態(tài)保溫。如溫度過高會導(dǎo)致SRBC溶血或所加入脾細(xì)胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發(fā)生凝固，影響上層瓊脂平板的制備
2. 離體的脾細(xì)胞應(yīng)置4℃冰箱保存，防止抗體分泌和細(xì)胞死亡。
3. 在制備試驗(yàn)平皿時(shí)，對于所有玻璃器皿和各種試劑，均需預(yù)溫，牭1各種試劑加入華氏管后，應(yīng)與0.7％瓊脂迅速充分混勻，然后立即傾倒于底層瓊脂上，并避免傾入氣泡。
4. 加入的補(bǔ)體應(yīng)均勻覆蓋于表層瓊脂上。
5. 制備底層平皿和試驗(yàn)平皿時(shí)，均須將平皿置于水平臺上，以保證瓊脂面鋪平。
一、原理：
溶血空斑形成試驗(yàn)的基本原理是將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞與一定量的綿羊紅細(xì)胞混合，在補(bǔ)體參與下，使抗體形成細(xì)胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細(xì)胞溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。根據(jù)所操作的方法不同可分為直接溶血空斑試驗(yàn)，間接溶血空斑試驗(yàn)，瓊脂固相法，小室液相法，單細(xì)胞層法等等。下面介紹直接溶血空斑形成試驗(yàn)。
二、操作步驟：
1. 底層瓊脂平皿的制備：將1.4％瓊脂加熱融化后傾注于平皿內(nèi)，每個(gè)平皿6ml，凝固后置濕盒37℃?zhèn)溆谩?br />2. 0.7％瓊脂加熱融化后加入華氏管內(nèi)，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。
3. 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液制備：用4×10３ 個(gè)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對照為等量生理鹽水。4天后，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾臟，用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3～8×10６/ml。臺盼蘭染色查活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于90％。置4℃冰箱備用。
4. 試驗(yàn)平皿的制備：依次將預(yù)溫40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4℃的脾細(xì)胞懸液各0.1ml加入預(yù)熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內(nèi)，凝固后，置37℃孵育1小時(shí)。
5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表面,再次置37℃溫育30分鐘，即可用肉眼或借助于放大鏡進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)。
三、試劑和器材
㈠ 試劑
1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配制。
2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配制
3. 25％SRBC鹽水懸液
4. RPMI1640
5. 胎牛血清，56℃30分鐘滅活，并經(jīng)SRBC吸收
6. 補(bǔ)體：新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)SRBC吸收后，用RPMI1640稀釋。
㈡ 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管，1ml注射器，不銹鋼篩網(wǎng)，青霉素瓶，離心管，不同規(guī)格加樣器等。
四、注意事項(xiàng)：
1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態(tài)保溫。如溫度過高會導(dǎo)致SRBC溶血或所加入脾細(xì)胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發(fā)生凝固，影響上層瓊脂平板的制備
2. 離體的脾細(xì)胞應(yīng)置4℃冰箱保存，防止抗體分泌和細(xì)胞死亡。
3. 在制備試驗(yàn)平皿時(shí)，對于所有玻璃器皿和各種試劑，均需預(yù)溫，牭1各種試劑加入華氏管后，應(yīng)與0.7％瓊脂迅速充分混勻，然后立即傾倒于底層瓊脂上，并避免傾入氣泡。
4. 加入的補(bǔ)體應(yīng)均勻覆蓋于表層瓊脂上。
5. 制備底層平皿和試驗(yàn)平皿時(shí)，均須將平皿置于水平臺上，以保證瓊脂面鋪平。