固定
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養(yǎng)，可阻斷色素的形成)
一. 原位雜交第一天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。
2） 置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次
4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實(shí)驗(yàn)不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(zhǎng)。發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2. 預(yù)雜交
1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）60℃水浴，預(yù)雜交4小時(shí)以上。
3. 雜交
1）吸去預(yù)雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）..
2）60℃ 溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預(yù)雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結(jié)合越好，溫度越高，背景越小。
二. 原位雜交第二天
1.
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復(fù)使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。
3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。
2.
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過(guò)夜。
三. 原位雜交第三天
1） 用1ml含10％熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色。
4）每隔一小時(shí)觀察胚胎是否開(kāi)始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
原位雜交中溶液的配制：
PBS:
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 調(diào)PH值至7.4
抽濾，滅菌
4% 多聚甲醛：
多聚甲醛 40g
PBS 1L
加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清。-20℃保存
PBST：
PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
20XSSC:
Na3Citrate 2H2O 88.2g
NaCl 175.5g
DEPC H2O 至1L
抽濾，滅菌
SSCT：
SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：
甲酰胺：20XSSC儲(chǔ)液：DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存。
HYB ：
HYB- 20ml
yeast RNA 10mg
heparin 1mg。
-20℃保存。
MAB：
maleic acid 11.6g
NaCl 8.8g
用固體NaOH（約7g）調(diào)至Ph=7.5
4℃保存
MABT
MAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.
10% blocking reagent:
blocking reagent 8g
MAB 72ml
1：2：7溶液：
滅活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7
用時(shí)現(xiàn)配
Staining buffer：
Tris 12.1g
pH9.5
Mgcl 6H2O 10.2g,
Nacl 5.85g
Tween-20 1ml,
用之前加1M的左旋咪唑儲(chǔ)液，使之終濃度為1mM
