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瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系
① DNA分子的大小 在凝膠中，DNA段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
② 瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
| 瓊脂糖濃度/％ | 0.3 | 0.6 | 0.7 | 0.9 | 1.2 | 1.5 | 2.0 |
| 線狀DNA大小/kb | 60－5 | 20－1 | 10－0.8 | 7－0.5 | 6－0.4 | 4－0.2 | 3－0.1 |
2、核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系
不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
