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自主序列復(fù)制系統(tǒng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
  自主序列復(fù)制系統(tǒng)(self-sustainedsequence replication,3SR),又稱依賴核酸序列的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)或再生長序列復(fù)制技術(shù).1990年Guatelli等首先報(bào)道了這一技術(shù).NASBA主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測及測序.該反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協(xié)作而完成.
  3SR反應(yīng)體系中除含有上述三種酶外,還含有dNTP,NTP(核糖核苷),兩種特殊的引物和緩沖液.引物I3'末端與靶序列互補(bǔ),5'端含T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子,這一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的堿基序列與cDNA的5'未端互補(bǔ).
  在3SR反應(yīng)時(shí),首先引物Ⅰ與RNA模板復(fù)性(結(jié)合),AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA,RNaseH水解cDNA上的RNA,形成一條單鏈的DNA;引物Ⅱ隨即與此cDNA的5'未端結(jié)合,逆轉(zhuǎn)錄酶在此DNA模板的指導(dǎo)下合成第二條DNA鏈.這樣形成的DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子.該酶即以此DNA為模板,轉(zhuǎn)錄出與樣品RNA序列相同的RNA鏈,而且每條DNA模板在該酶的作用下可合成約100個(gè)拷貝的RNA.每條新的RNA又可作為逆錄酶的模板合成cDNA.如此反復(fù)進(jìn)行,將獲得更多的RNA和cDNA.
  其基本方法為:將引物,標(biāo)本加入擴(kuò)增反應(yīng)液,65℃1min使RNA分子二級結(jié)構(gòu)打開,降溫至37℃加入逆轉(zhuǎn)錄酶,T7RNA聚合酶和RNaseH,并在37℃反應(yīng)1~1.5小時(shí),其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳,溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶.NASBA的特點(diǎn)為操作簡便,不需特殊儀器,不需溫度循環(huán).整個(gè)反應(yīng)過程由三種酶控制,循環(huán)次數(shù)少,忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR,特異性好.
 
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